Использование современных методов хромато-масс-спектрометрии для анализа «чудесных жидкостей», появляющихся на предметах религиозного культа

Введение

Самопроизвольное появление различных жидкостей на предметах религиозного культа, прежде всего на христианских статуях и иконах, в религиозной среде чаще всего связывают с проявлением чуда. Как правило, речь идёт о внезапном возникновении на поверхности иконы или статуи маслянистых жидкостей («миро»¹), крови, капель воды в уголках глаз изображённого образа («слёзы») и др. Несмотря на появляющейся ажиотаж среди верующих и паломников вокруг таких «чудесных» предметов культа, в христианстве принято сдержанное и даже скептическое отношение к подобным «чудесным явлениям», что исходит из учения самой Церкви²: «не всякому чуду верьте» (1 Ин. 4:1). Считается, что все истинные чудеса не несут ничего нового, чего не было бы в Евангелии, в церковном наследии. Напротив, ложные чудеса могут внести только разлад и раскол в сообщество верующих, оттолкнув их от Бога.

Подобное критическое отношение к чудесам со стороны Церкви послужило основой для их строго исследования в рамках научной парадигмы. Например, ещё в XIX веке в России действовали жесткие правила об освидетельствовании икон: в случае «мироточения» икона опечатывалась, при этом было обязательным проведение урядником специального расследования на предмет возможных фальсификаций [9, с. 19–20]. В конце XX века, с созданием новой инструментальной базы для анализа вещества и соответствующего методологического аппарата, различными лабораториями и группами учёных были проведены уже полномасштабные исследования «чудесных образцов» жидкостей, полученных с предметов культа, прежде всего с привлечением методов спектрометрии и хроматографии [8, с. 9–18]. В этом отношении наука дала современные инструменты изучения любого неидентифицируемого вещества и, тем самым, позволила беспристрастно изучать феномен появления «чудесных жидкостей» на предметах религиозного культа.

Научные исследования «чудес», связанных с веществом икон, на постсоветском пространстве были начаты почти четверть века назад, когда была создана экспертная рабочая группа по описанию чудесных знамений в Русской Православной церкви (РПЦ) при Синодальной Богословской комиссии Московского Патриархата (далее – Экспертная группа). В данной статье представлены результаты последних исследований образцов «мироточащих» и кровоточащих икон, выполненных в рамках работы Экспертной группы, с применением современных методов исследования вещества: масс-спектрометрии, высокоэффективной газовой хроматографии органических соединений (химически модифицированных липидов – этерифицированных жирных кислот) сопряженной с масс-спектроскопией, а также методами липидомики (масс-спектрометрии интактных липидов и сопутствующих им компонентов) с прямым внесением вещества в масс-спектрометр и протеомики (высокоэффективной жидкостной хроматографии сопряженной с масс-спектрометрией). Авторы полагают, что наряду с фальсификацией и неаккуратным уходом за иконой или иным предметом культа, есть и что-то другое (часть вполне естественных процессов, приводящих к появлению жидкостей на иконах [2, с. 257–270]), что и стало предметом нашего внимания.

Хромато-масс-спектрометрия и липидомика для анализа вещества

Большинство доступных научных исследований «мироточащих» и/или кровоточащих предметов культа (прежде всего икон и статуй) построено на определении состава вещества с использованием различных методов хроматографии и спектрометрии. Хроматография (от греч. chroma, chromatos – цвет, краска) представляет собой физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами – неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную [5]. Хроматографический анализ является критерием однородности вещества: если каким-либо хроматографическим способом анализируемое вещество не разделилось, то его считают однородным (без примесей). Принципиальным отличием хроматографических методов от других физико-химических методов анализа является возможность разделения близких по свойствам веществ. После разделения компоненты анализируемой смеси можно идентифицировать (установить природу) и количественно определять (массу, концентрацию) любыми химическими, физическими и физико-химическими методами. Для углубленного анализа вещества, в том числе и при исследовании «чудесных жидкостей» [1, 2, 8], довольно часто для идентификации вещества используется хроматография в сочетании с другими физико-химическими и физическими методами, например, ИК-, УФ-спектроскопией и др.

Масс-спектрометрия – один из наиболее мощных и информативных методов исследования структуры органических соединений и химического анализа сложных веществ и их смесей. Это прямой метод, позволяющий непосредственно определять молекулярную массу, элементный состав молекул и их фрагментов, их связь между собой и взаимное расположение, а также позволяющий изучать механизмы фрагментации [6, с. 57–62]. Масс-спектрометрия также позволяет получить важную информацию об изотопном составе анализируемых молекул.

При этом масс-спектрометр сам по себе рассматривают как отличный детектор для газовой хроматографии. Как газовый хроматограф, так и масс-спектрометр представляют собой в принципе относительно несложные приборы, а получаемые с помощью каждого из них аналитические данные просты для понимания и использования. Однако, когда эти два прибора напрямую соединяют в единую хромато-масс-спектрометрическую систему (рис. 1), возможности такой системы не равны просто сумме возможностей каждого прибора; аналитические возможности увеличиваются экспоненциально. Для того, чтобы реализовать весь потенциал, заключенный в громадном количестве данных, генерируемых хромато-масс-спектрометром, необходим специализированный компьютер. С подключением компьютера к прибору становятся возможными многие операции с данными, увеличивающие их аналитическую ценность. Полученные с помощью такого детектора спектры дают более подробную информацию о качественном составе пробы, какую не могут дать иные хроматографические детекторы.

Рис. 1. Внешний вид жидкостного хроматографа и масс спектрометра «Orbitrep», который использовался авторами для анализа образцов «миро» и крови с православных икон методами липидомики и протеомики.

 

На наш взгляд, современными перспективными способами анализа «чудесных жидкостей» являются также методы на основе липидомики, под которой в общем значении понимается идентификация и количественное измерение липидов биологического объекта [24, с. 479–526]. Однако вместо широкого и крайне многогранного понятия термина «липидомика» в данном исследовании мы подразумеваем его намного более узкое значение, а именно – высокоэффективную масс-спектрометрию всей совокупности интактных (не подверженных какому-либо химическому и/или термическому воздействию) липидов и сопутствующих им компонентов, входящих в состав исследуемого вещества (в данном случае «миро») с последующим их детальным анализом с применением высокопроизводительных компьютерных вычислений [13, с. 100–120].

Использование хромато-масс-спектрометрии при анализе «мироточащих» и кровоточащих икон

Обзор немногочисленных научных исследований в этой области показывает, что методы хромато-масс-спектрометрии чаще всего являются эффективным инструментом для анализа образцов «мироточения» [8]. Например, исследование образцов вещества, появившегося в квартире на иконах А. А. Фоминой в 2007 году (г. Северск Томской обл.), включало элементный анализ, ИК-, УФ-, 1H-, 13С-ЯМР-спектроскопию, газожидкостную хроматографию (ГЖХ) и хромато-масс-спектрометрию, а также определение молекулярной массы. Вещество было идентифицировано как смесь жиров типа оливкового масла с различными примесями, в том числе витамина Е (С₂₉H₅₃O₂), содержащегося в растительных маслах (табл. 1). Инфракрасные спектры оливкового и кукурузного масла на 95–96% совпадали со спектрами «миро» [3]. Образец «миро» представлял собой смесь органических соединений различного строения. Установлено наличие в нем в небольших концентрациях углеводородов нормального строения (данные ГЖХ и GC-MS-анализа), а также значительного количества кислородсодержащих соединений. В пользу этого свидетельствовали результаты элементного анализа, ИК-, ЯМР- и GC-MS-исследований. Идентифицированы такие кислородсодержащие соединения как 2,4-декадиеналь (цис- и транс-изомеры), фарнезол, токоферолы, стигмастерол и др. Однако следует учесть, что в образце «миро» может содержаться больше соединений, чем удалось идентифицировать, в связи с особенностями их физико-химических свойств (низкая летучесть, высокие температуры кипения и др.) [3].

В итоге, совместное использование целой группы методов анализа вещества позволило установить, что довольно часто вещество с поверхности иконы может быть идентично органическим маслам и близко по составу ароматизированному подсолнечному, оливковому или кукурузному маслу. Органические соединения, входящие в состав того или иного масла, немного отличаются, поэтому и вещества с разных икон также различны [9, с. 11–36]. Однако это зачастую масла не нефтяного ряда, т. е. не минеральные масла, получаемые из нефтепродуктов [8, с. 11–36]. В свою очередь, лампадное масло представляет собой смесь насыщенных углеводородов нормального, изо- и циклического строения, тогда как образцы миро отличались от него в ИК, УФ, ЯМР и масс-спектрах (рис. 2) [3].

Рис. 2. Сравнение ИК-спектров «миро» и лампадного масла (г. Северск, 2007 год).

 

Схожие результаты были получены в лаборатории масс-спектрометрии г. Павия (Италия) при изучении периодически «мироточащей» иконы Богородицы из православной церкви Святого Николая (г. Милан) (рис. 3). Как отмечается в одной из статей [25], анализ вещества «миро» показал, что это было «некое растительное масло». Такой результат позволил исследователю М. Полидоро опровергнуть исходное предположение, что такое масло «произвела» сама икона. Он апеллировал к простым тезисам, что, во-первых, масляная краска сделана на основе минерального масла (т. к. растительные масла легко портятся) и, во-вторых, если бы имело место естественное просачивание капель масла, то это происходило бы по всей иконе, однако «мироточила» только малая область вокруг глаз Богородицы и младенца Иисуса.

Рис. 3. Изучение мироточащей иконы Богородицы в церки Святого Николая (Милан, Италия, 2010 год).

 

Однако не во всех исследованиях удавалось так однозначно установить природу маслянистой жидкости («миро»). Так, в другой работе [23] специалисты аналитической лаборатории Kraft Food Ingredients (г. Мемфис, США) применили метод газовой хроматографии для анализа состава жирных кислот в двух образцах «миро», взятых из комнаты Линды Санто (Междугорье, Босния и Герцеговина). Девочка Линда, находившаяся более 20 лет в состоянии комы после несчастного случая, стала предметом поклонения и источником чудес среди католиков, в частности, в её присутствии «мироточили» различные предметы христианского культа. В лаборатории были проанализированы образцы «миро», взятые с золотой чаши для причастия (образец № 1) и головы фигурки младенца Иисуса (образец № 2) (рис. 4) из комнаты Линды Санто. Содержание четырех основных жирных кислот (16:1 – пальмитиновая; 18:1 – олеиновая; 18:2 – линолевая; 16:3 – линоленовая) в этих двух образцах и в пищевых маслах представлены в таблице 2.

Рис. 4. «Мироточащие» предметы в комнате Линды Санто (Междугорье, Босния и Герцеговина, 1996 год): золотая чаша для Причастия (слева) и фигурка младенца Иисуса (справа).

 

По результатам проведённого анализа, биохимик Б. Липински пришел к заключению, что содержание жирных кислот в образцах «миро из комнаты Линды Санто, отличается от любого из имеющихся в продаже масел, а значит имеет неизвестную природу» [23].

Рис. 5. Взятие образцов миро: а) с иконы Пантелеймона Целителя; б) с иконы Иверской Божьей Матери (г. Клин-9, Россия, 2002 год).

 

По инициативе Экспертной группы в 2002 году было проведено углублённое физико-химическое исследование четырех образцов различных маслянистых жидкостей из г. Клин-9 методами спектроскопии протонного магнитного резонанса (ПМР), ХМС и инфракрасной спектроскопии. От каждого образца были отобраны три пробы по 0,08 мг и переданы для параллельной идентификации (рис. 5). В результате был получен изотопный состав углерода, представленный следующими величинами δ¹³С относительно PDB в промилле для четырёх образцов соответственно: –29,2; –28,7; –27,7; –27,5. Все три исследования показали, что образцы по своему химическому составу идентичны растительному маслу, наиболее близкий аналог – подсолнечное масло [4, с. 229–230].

Продукты биологического происхождения имеют индивидуальный для каждого из них изотопный состав, который незначительно меняется в различных регионах. Биогенные соединения по соотношению изотопов углерода ¹²C и ¹³С обладали диапазонами различия в несколько десятков промилле, однако в результате исследования было установлено, что изотопный состав всех образцов по ¹²C и ¹³С в пределах точности измерений был полностью идентичен подсолнечному маслу, произведенному в России [9, с. 11–36].

Как отмечалось в предыдущей нашей работе [8], собирательным термином «мироточение» могут называть сходные по своей структуре процессы и явления, один из которых авторы уже подробно описывали ранее: предположительно за «миро» могут приниматься специфические выделения плесневых грибов (или некоторых микроорганизмов) [1, с. 121–129]. В этом случае состав возникающих на иконах или иных предметах культа жидкостей, предположительно, будет отличаться от масел. Однако методы хромато-масс-спектрометрии и здесь позволяют установить природу неизвестных выделений. Так, пробы бесцветного маслянистого вещества, взятые в 2006 году в квартире А. А. Пимоновой (г. Томск), были изучены в лаборатории углеводородов и высокомолекулярных соединений Института химии нефти Сибирского отделения РАН. Анализы показали, что субстанция представляла собой смесь нормальных алканов [7] (C₂₂–C₃₅) с максимумом распределения, приходящимся на соединения состава C₂₆–С₂₉, фталатов, жирных кислот (пальмитиновой, стеариновой, арахиновой, линоленовой), акролеина и сквалена. Инфракрасные спектры поглощения экстрактов характеризовались широкими полосами поглощения в области 1750–1730 см^-1 – колебания карбонильной группы в области 3000–2500 см^-1 – валентные колебания гидроксильной группы в области 1400–1200 см^-1 – деформационные колебания О–H и валентные C–O. Таким образом, данные, полученные методом ИК-спектрометрии подтверждали присутствие в пробе жирных карбоновых кислот [7].

Аналогичные исследования с использованием хромато-масс-спектрометрии, проведенные авторами в 2015 году с образцом вещества, выделившегося из-под наклеек, используемых в современном православии при освящении квартир (г. Брест, Беларусь), выявили, что оно содержит фталаты, эфиры и ангидрид фталевой кислоты (целая фракция), определенные силикаты, глицерин и другие соединения (рис. 6). Из них некоторые соли и эфиры фталевой кислоты могли входить в клеевую основу наклеек (и являться субстратом для развития, предположительно, плесневых грибов) [1].

Рис. 6. Химическая идентификация веществ, присутствующих в образце (г. Брест, Беларусь, 2015 год): 1 – пальмитиновая кислота, 2 – стеариновая кислота, 3 – миристиновая кислота и 4 – производные фталевой кислоты.

 

Хромато-масс-спектрометрия может быть задействована также и в случае химического анализа образцов кровоточения предметов религиозного культа. Например, при исследовании кровоточения иконы Казанской Божьей Матери из г. Клин-9 (Россия) наличие крови в образце устанавливалось микроспектральным методом и методом горизонтальной хроматографии. Экспертиза проводилась в 2002 году в Цитологической лаборатории Центра судебно-медицинских и криминалистических экспертиз Министерства обороны Российской Федерации [10]. На экспертизу были представлены три ватных тампона, пропитанных маслянистым веществом, на поверхности которых имелись наложения частиц вещества коричнево-бурого цвета (образец № 1–3); марлевый тампон, на поверхности которого имелись наложения частиц вещества коричнево-бурого цвета (образец № 4); вещество коричнево-бурого цвета в виде сухих порошкообразных частиц в пластиковой пробирке типа Эппендорф. Наличие крови устанавливалось микроспектральным методом и методом горизонтальной хроматографии. Видовую принадлежность крови устанавливали реакцией преципитации в жидкой среде. Использовали сыворотки, преципитирующие белки крови человека, мелкого рогатого скота и свиньи (соответственно серий 1, 31 и 79). Сыворотки предварительно проверяли в отношении титра и специфичности. Во всех исследуемых следах крови (образцы № 1–5) выявлен белок человека.

Проведенное исследование пяти образцов из г. Клин-9 позволило установить, что:

1. На представленных для исследования трех ватных тампонах (образцы № 1–3) обнаружена кровь человека, при определении групповой принадлежности которой выявлен антиген А, что не исключает происхождения этой крови от лица с группой крови А (II).

2. На марлевом тампоне, и в веществе, находящемся в пробирке (образцы № 4 и 5), обнаружена кровь человека женского генетического пола. При определении групповой принадлежности выявлен антиген А, что не исключает происхождения этой крови от женщины с группой крови А (II).

Необходимо также отметить, что имеется целая группа всемирно известных образцов «чудесных жидкостей», принимаемых за человеческую кровь, которые пока остаются без полноценного химического анализа. Прежде всего, речь здесь идёт о различных реликтах крови святых в Италии, таких как образец крови Святого Януария (г. Неаполь) или Святого Лоренцо (г. Амазено), которые проявляют необычные свойства. Как правило, они хранятся в специальных стеклянных колбах. Некоторые из этих образцов крови в определённых случаях (например, при проведении религиозных церемоний) переходят из обычного сгущенного состояния в жидкое и наоборот, что представляется довольно необычным и пока необъяснимым процессом. В некоторых работах [16, с. 507; 17, с. 123] исследователи предположили, что в основе такого невероятного процесса, лежит явление тиксотропии, под которым понимается свойство некоторых гелей разжижаться при перемешивании или вибрации и снова затвердевать, когда их оставляют стоять. В поддержку этой гипотезы исследователям даже удалось подготовить контрольные тиксотропные образцы, очень похожие на реликвию Януария, используя материалы и методы, доступные в XVI веке.

Рис. 7. Стеклянный сосуд с «кровью» Святого Лоренцо, который хранится в Церкви Св. Марии (г. Амазено, Италия).

 

Химику Л. Гарлашелли из Университета Павии (Италия) удалось осмотреть сосуд с «кровью» Святого Лоренцо и выполнить с ним несколько простейших исследований [18, с. 417]. Сосуд содержит ориентировочно 35 мл смесей различных веществ: жидкость тёмно-красного цвета, смешанную с жиром, комковатый слой коричневого цвета (вероятно песок или зола) и некий тёмный материал, обычно принимаемый верующими за обугленный фрагмент кожи святого (рис. 7). «Чудесная» трансформация вещества в сосуде происходит 10 августа – день, когда Святой Лоренцо принял мученическую смерть. В этот день реликвия запирается в стеклянном шкафу и ее дальнейшие изменения в последующие дни могут несколько раз проверяться путем открытия сейфа.

После исследования химик Л. Гарлашелли с коллегами пришёл к выводу, что красное вещество в сосуде, вероятно, не может быть кровью, поскольку цельная кровь обычно непрозрачна. В этом случае даже прозрачный раствор гемоглобина разложился бы и потерял свой ярко-красный цвет на протяжении веков, а водный раствор высох бы в несовершенно закрытой колбе и не застыл бы при 30 ^°С³. Проверка возможного тиксотропного фазового перехода путём вращения в смесителе Maxi Mixer, показала, что единственным результатом было то, что два верхних слоя стали слегка смешанными. При этом, температура размягчения (или плавления) и общий внешний вид позволили предположить, что реликвия состоит из жиров, восков или их смесей, возможно, содержащих соответствующий маслорастворимый красный краситель. Преобладание насыщенных жирных кислот в триглицеридах приводит к значительно более высоким значениям плавления жиров. Насыщенные жиры также более устойчивы к окислению и прогорканию. Поскольку вещество реликвии, по-видимому, было довольно стабильным на протяжении веков, следует предположить, что в нем содержится большое количество насыщенных жирных кислот. Однако Л. Гарлашелли и его коллеги по изучению реликвии признают, что окончательные выводы можно будет сделать только, после проведения анализа стандартными спектрометрическими и хроматографическими методами.

Хромато-масс-спектрометрический анализ образцов «миро» и крови с православных икон из г. Клин-9 и г. Локоть

В 2004 году факты многочисленного «мироточения» икон были засвидетельствованы Экспертной группой в г. Локоть. В состав группы входил также один из авторов данной статьи – П. В. Флоренский. Были взяты многочисленные пробы «миро» для проведения последующего анализа. Среди таких образцов была и маслянистая жидкость, полученная с иконы Иверской Божьей матери. Детальное изучение субстанции стало возможным только в 2018 году. Анализ выделений был проведен в современной лаборатории отдела биохимии Фрибурского университета (Швейцария). Исследование проводилось на высокоэффективном газовом хроматографе Hewlett-Packard 5890 с масс-спектрометрическим окончанием (использовался масс-спектрометр Hewlett-Packard 5927, широко применяемый в этой области анализа) [11, с. 526–537].

Молекулы маслянистой жидкости (предположительно – смесь, состоящая из триацилглицеридов) перед внесением в хроматограф были подвергнуты щадящему гидролизу и этерификации (предположительно до метилэфиров жирных кислот) – рисунок 8. Данная процедура была призвана перевести ожидаемые полярные молекулы, входящие в состав маслянистой жидкости (липиды и жирные кислоты), в неполярные органические соединения – т. е. в такое состояние органических молекул, которое можно проанализировать при помощи газового хроматографа. В качестве контроля нами было использовано подсолнечное (марка «Bellasan», производство Бразилия) и оливковое (марка «Bertolli», производство Италия) масло (рис. 9).

Рис. 8. Внешний вид газового хроматографа и масс-спектрометра Hewlett-Packard, которые использовались авторами для анализа образцов «миро» с православных икон методом высокоэффективной газовой хроматографии сопряженной с масс-спектрометрией.

 

Риc. 9. Образцы во время экстракции: (1) подсолнечное масло, (2) оливковое масло, (3) «миро» с иконы Иверской Божьей Матери.

 

Нами установлено практически полное совпадение жирнокислотного состава исследуемой жидкости с жирнокислотным составом подсолнечного масла (рис. 10). При этом найденные незначительные отличия в составах были обусловлены наличием некоторых органических соединений, входящих в состав бытовых полимеров (пластиков), – фталатов, а также соединений, входящих в состав современных синтетических красителей. Данные соединения могли попасть в маслянистую жидкость с поверхности иконы или поверхности пластиковой кюветы, куда собиралась анализируемая субстанция.

Рис. 10. Результаты анализа образцов из г. Локоть, полученные при проведении газовой хроматографии.

 

Параллельно образец «миро» был проанализирован методом липидомики с прямой инъекцией в масс-спектрометр (Thermo Scientific^™ Q Exactive^™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap^™ Mass Spectrometer) с применением интенсивного компьютерного анализа. Для поиска различных примесей, таких как, например, гербициды, фунгициды, флавоны и флавоноиды, была использована программа NIST MS Search 2.0 с библиотекой компонентов NIST Spectral Library EPA NIH 2008. Важно отметить, что в отличие от газовой хроматографии, при работе липидомическим методом используют образец, не подвергнутый никаким химическим и/или термическим модификациям. Вследствие чего можно наблюдать намного более широкий спектр (разнообразие) молекул в анализируемом образце.

Важно отметить, что помимо соединений, входящих в состав подсолнечного масла (к примеру, токоферола, ретиноевой кислоты, триацилглицеролов, диацилглицеролов, моноацилглицеролов) нами были также обнаружены примеси предположительно растительных эфирных масел – кипарисового масла (флавоноид сциадоптизин) и масла мяты (флавоны диадзин и генистен). На рисунке 11 полосы спектров основных идентифицированных компонентов в «миро» пронумерованы: P1, P2 …P20 (позитивный режим масс-спектрометрии) и N1, N2 …N13 (негативный режим масс-спектрометрии). Такие компоненты как фунгициды, гербициды, флавоноиды и т.д. на спектрах не обозначены (кроме полистахина), поскольку представляют собой шумовые примеси и не выделяются в отдельные спектральные полосы.

Рис. 11. Профили масс-спектрометрии «миро», полученные с помощью липидомического анализа.

 

Использование методов липидомики позволило предположить, что в составе анализируемого образца, помимо подсолнечного масла как основного компонента, могли присутствовать примеси многокомпонентных благовоний, используемых для ароматизации церковных и жилых помещений, и, возможно, именно они обуславливали необычный запах «миро». Остаточные количества действующих веществ некоторых гербицидов и фунгицидов также вполне закономерны, если на полях проводилась интегрированная система мероприятий по защите растений подсолнечника от болезней и сорняков. Обнаруженные следы жизнедеятельности грибков позволяют предположить, что последние могли паразитировать на поверхности маслосемян и попали в выделяемое из них масло.

В 2002 году Экспертной группой также были взяты образцы тёмно-красных выделений, появившихся на иконе Казанской Божьей Матери в г. Клин-9 [2]. Очевидцы принимали эти выделения за человеческую кровь. Как уже отмечалось выше, эти образцы ранее были проанализированы в лаборатории Минобороны РФ. В 2018 году работа по дальнейшему углубленному протеомическому анализу кровавых выделений была также выполнена в отделе биохимии Фрибурского университета (Швейцария). При анализе использовались классические и отработанные нами ранее методы секвенирования белка [15]. Наши исследования подтвердили, что образец содержит белки крови.

Первоначально для выяснения вида живых организмов, к которому относятся твердые частицы («кровавые выделения»), напоминающие коагулированную засохшую кровь (рис. 12), нами была предпринята дифференциальная масс-спектроскопия белка по типу nanoLC-ESI-MS/MS [20, с. 115–126], выполненная на базе высокоэффективного масс-спектрографа, сопряженного с жидкостным хроматографом Thermo Fischer Scientific Q Exactive^™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap^™ [27]. Из засохших гранулоподобных частиц белок был выделен и переведен в растворимое в воде состояние при помощи таких денатурирующих соединений как мочевина и тиомочевина. Суммарный белок был ферментативно расщеплен до смеси пептидов при помощи генетически модифицированного свиного трипсина Promega Sequencing Grade Modified Trypsin.

Рис. 12. Образец крови в растворителе (а) и внешний вид образца после очистки (б).

 

Кровь была проанализирована на принадлежность к 16 распространённым живым организмам, включая человека, кошку, собаку, свинью. Установлено, что белки человека обнаруживаются в намного большем количестве и с намного более высокой достоверностью по сравнению с белками контрольных животных (рис. 13). При этом ложноположительное обнаружение белков крови вышеназванных животных объясняется их высокой схожестью с белками крови человека, что обусловлено их эволюционно-генетическим родством. Но обнаружение белков крови человека с наибольшей степенью покрытия аминокислотных последовательностей, количества значимых MS/MS событий и уровней достоверности обнаруживаемых пептидов позволило полностью исключить животное происхождение крови.

Рис. 13. Результаты анализа тёмно-красных выделений с иконы Казанской Божьей Матери на видовую принадлежность.

 

Несмотря на давность образца, расширенный анализ на человеческую протеому позволил идентифицировать множество различных белков, большая часть из которых характерна для крови обычного человека. При этом применение высокоразрешающей масс-спектроскопии и глубоких методов компьютерного анализа (программируемый параметр: специфическое расщепление трипсином, полуспецифическое расщепление трипсином и отдельно – неспецифический поиск белков) при помощи пакета MaxQuant 1.6.3.3 позволило обнаружить 395 белков крови человека в старой и высушенной крови, что даже превышает количество в 231 белок, обнаруженное для сравнения в свежей крови добровольцев при использовании обычного поиска (программируемый параметр: специфическое расщепление трипсином) и программного продукта Mascot [27].

Помимо прочего, масс-спектроскопия позволила установить наличие нескольких белков (OR5AL1, OR6Q1, OR1S1 и OR1S2), которые являются маркерами обонятельных клеток носовой полости, а также выявлены белки синдрома Вискотта-Олдрича (встречающееся с частотой 4:1000000 у родившихся живыми мальчиков), андроглобина, и сперматогенез ассоциированного белка, которые чаще всего встречаются у лиц мужского пола. Также исследуемый образец содержал белок, кодируемый геном BBS2, мутация которого может приводить к развитию крайне редкого генетического заболевания – синдрома Барде-Бидля (встречающееся с частотой 1:120000 новорожденных в Европе и Северной Америке). На основании этого у авторов возникло предположение, что кровь могла принадлежать какому-либо из паломников, у которого развилось носовое кровотечение в тот момент, когда он прикладывался к иконе.

В итоге наше исследование подтвердило, что образец с иконы Казанской Божьей Матери содержит белки человеческой крови мужского пола, которые удалось четко идентифицировать по целому ряду характерных пептидов для каждого индивидуального белка. Однако эти результаты расходятся с данными, полученными в лаборатории Минобороны РФ, когда подобный анализ позволил установить, что кровь с иконы была женской. Вероятнее всего, первоначальный анализ был выполнен с использованием несколько менее совершенных методик, либо изначально на разных частях иконы могла присутствовать разная кровь, как мужская, так и женская (по аналогии с образцами крови на статуи Божьей Матери Акитской из г. Акито, когда анализ указал на разные группы крови) [21, с. 113–114].

Заключение

Методы хромато-масс-спектрометрии позволяют эффективно устанавливать природу вещества «чудесных жидкостей», появляющихся на предметах религиозного культа, даже в случаях, когда изучаемый образец имеет большую давность. В большинстве случаев применение таких методов позволяет идентифицировать продукты «мироточения» как растительное масло (чаще всего подсолнечное или оливковое) с содержанием различных примесей, а «кровоточения» – как человеческую кровь разной группы и гендерной принадлежности. Помимо определения природы вещества таких жидкостей (масло, кровь), хромато-масс-спектрометрия совместно с интенсивным компьютерным анализом, а также другими методами (липидомики, протеомики, секвенирования белка и др.) даёт возможность выявить их индивидуальные особенности, такие как: содержание различных примесей в маслах (действующие вещества гербицидов и фунгицидов, флавоноиды, следы жизнедеятельности грибков и др.), индивидуальные особенности образцов крови (генетические заболевания, примерный регион проживания донора крови, возможный источник кровоточения на теле и др.).

Важно отметить, что сама по себе идентификация «чудесной жидкости» как растительного масла или человеческой крови не доказывает или не опровергает факт чуда. В этом отношении крайне важно знать, при каких обстоятельствах был взят образец такой жидкости. Например, были ли соблюдены определённые протоколы опечатывания иконы или иного предмета культа или помещения, где она находится. При этом экспертной группе важно знать возможные приёмы фальсификации «чудесного явления», чтобы она могла их обнаружить или исключить. Так, Л. Гарлашелли описывает простой приём того, как «заставить плакать статую». Исследователь подчёркивает, что в этом случае необходима полая статуя, сделанная из пористого материала, такого как гипс или керамика. При этом она должна быть застеклена или окрашена каким-то непроницаемым покрытием. В этом случае, если статуя будет заполнена жидкостью (например, тайно, через крошечное отверстие в голове), то пористый материал поглотит жидкость, однако остекление не даст ей вытечь. Если же, покрытие статуи «будет незаметно поцарапано на или вокруг глаз, то капли будут вытекать из неё так, как будто они материализуются из воздуха» [19, с. 534].

Однако только методы хромато-масс-спектрометрии по ряду косвенных признаков могут приблизить нас к установлению истины относительно «чудесного явления». Так, в одном из случаев [4], было выявлено полное совпадение изотопных составов двух образцов – образца «миро» и подсолнечного масла из обычной бутылки, купленной в магазине. В случае фальсификации «мироточения» этот результат тривиален. Однако, если экспертной группе каким-либо образом получится достоверно исключить факт фальсификации или случайного попадания масла на икону, то неразличимость изотопных составов будет уже представляться исключительным событием. Очевидно, что в этом случае не будет разумных оснований говорить о какой-либо предыстории вещества, и, следовательно, ожидать, что изотопный состав образцов «миро» будет похож на состав природных масел. Такой невероятный процесс потребует применения иного набора методов инструментального анализа, которые лежат за рамками тематики данного материала.

Примечания

1. На самом деле, миро – это священное масло, которое при особом богослужении варит патриарх или католикос в сослужении епископов. Поэтому в дальнейшем, оставив в статье слово миро и производные от него, мы будем употреблять их в кавычках.

2. Далее в статье авторы рассматривают появления «чудесных жидкостей», которые происходят в христианской Церкви.

3. Л. Гарлашелли опытным путём (заморозкой с последующим нагревом) определил, что «кровь Лоренцо» застывает при температуре 30 °С, что характерно для растворов, содержащих насыщенные жирные кислоты и, вероятно, соответствует температуре плавления жиров. Такое поведение не характерно для чисто водных растворов и тем более для крови.

Литература

1. Алексинский В.С., Соколова Т.Н., Бутов И.С., Гайдучик В.Н., Солженицын Р.В. Феномен мироточения: новая гипотеза и химико-микробиологический анализ мироточащих объектов // Лабораторная диагностика. Восточная Европа. 2017. № 1. С. 121–129.

2. Бутов И.С., Томин Н.В., Флоренский П.В., Алексинский В.С., Московский А.В., Дебелый М.А. Феномен «кровоточащих» предметов религиозного культа и раскрытие его природы с использованием методов высокотехнологичного протеомического анализа // Лабораторная диагностика. Восточная Европа. 2019. Том. 8. №2. С. 257–270.

3. Головко А.К., Певнева Г.С., Огородников В.Д. [и др.]. Отчет по исследованию образцов «мирро» и масла «лампадного» / предисл. к отч. В. Н. Фефелова. Томск: Институт химии нефти СО РАН, 2007. 24 с.

4. Иванов А.А., Московский А.В., Сошинский С.А., Флоренский П.В. Физико-химический анализ веществ, возникших в результате мироточения // Физика взаимодействия живых объектов с окружающей средой: труды Междунар. совещания «Новые результаты в биофизике взаимодействия живых объектов с окружающей средой» (Москва, 7 декабря 2002 г.). М., 2004. С. 229–230.

5. Карасек Ф., Клемент Р. Введение в хромато-масс-спектрометрию. М.: Мир, 1993. 237 с.

6. Клюев Н.А., Бродский Е.С. Современные методы масс-спектрометрического анализа органических соединений // Российский химический журнал (Журнал Российского химического общества им. Д. И. Менделеева). 2002. № 4. Т. XLVI. C. 57–62.

7. Результаты исследования маслянистого вещества (аналитическая записка) / сост. Н. П. Савиных. Томск: Институт химии нефти СО РАН, 2006. 8 с.

8. Томин Н.В., Бутов И.С., Алексинский В.С., Московский А.В., Флоренский П.В., Дебелый М.А. Мироточащие иконы: что говорит наука? // Природа. 2019. №10. 2019. С. 9–18. DOI:10.7868/S0032874X19100028

9. Флоренский П.В., Московский А.В., Сошинский С.А., Шутова Т. А. Испытание чудом? // Чудеса истинные и ложные. М.: Даниловский благовестник, 2012. С. 11–36.

10. Харламов С.Г., Гургенидзе Е.В., Верченко И.В. Акт № 6/ген-2001 судебно-медицинского исследования вещественных доказательств 15 мая 2002 / Лаборатория генетической идентификации. Цитологическая лаборатория Центра судебно-медицинских и криминалистических экспертиз Министерства обороны Российской Федерации. М., 2002. 3 с.

11. Bielawska K, Dziakowska I., Roszkowska-Jakimiec W. “Chromatographic determination of fatty acids in biological material”. Toxicol Mech Methods. 20.9 (2009): 526–537.

12. Bever L.A “Virgin Mary statue has been ‘weeping’ olive oil. Church leaders can’t explain it” The Washington Post. 18.07 (2018) [Electronic resource] URL: https://www.washingtonpost.com/news/acts-of-faith/wp/2018/07/18/a-virgin-mary-statue-has-been-weeping-olive-oil-church-leaders-cant-explain-it/?noredirect=on&utm_term=.a91ad0711496. Date of access: 01.08.2018.

13. Byrdwell W.C. “Dual parallel liquid chromatography with dual mass spectrometry (LC2/MS2) for a total lipid analysis”. Front. Biosci. 13.13 (2008): 100–120.

14. Cox J., Mann M. “MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification”. Nat Biotechnol. 26.12 (2008): 1367–1372.

15. Debelyy M.O., Waridel P., Quadroni M., Schneiter R., Conzelmann A. Chemical crosslinking and mass spectrometry to elucidate the topology of integral membrane proteins. PLoS One. 12.10 (2017): e0186840. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0186840. Date of access: 04.05.18.

16. Garlaschelli L., Ramaccini F., Della Sala S. “Working Bloody Miracles”. Nature. 353 (1991): 507.

17. Garlaschelli L., Ramaccini F., Della Sala S. “A Miracle Diagnosis”. Chemistry in Britain. 30 (1994): 123.

18. Garlaschelli L. “Chemistry of “Supernatural” Substances”. J. Soc. Psyc. Res. 62.852 (1998): 417.

19. Garlaschelli L. “You can get blood from a stone”. Chemistry in Britain”. 31.7 (1995): 534.

20. Gaspari M., Cuda G. “Nano LC-MS/MS: a robust setup for proteomic analysis”. Methods Mol Biol. 790 (2011): 115–126.

21. Flinn F.K. “Encyclopedia of Catholicism”. New York: Facts on File (2007): 113–114.

22. Kocój E. Sacrum i łzy. “Fenomen płaczących ikon w wyobrażeniach religijnych w prawosławiu (wybrane zagadnienia)”. Slavica Slovaca. 2 (2015): 140–155.

23. Lipinski B. “Testing of the Weeping Oil in Little Audrey's Room”. Report. 27.01 (1994) [Electronic resource] URL: http://www.medjugorjeusa.org/boguslawreport.htm. Date of access: 02.02.19.

24. Murphy R. C. et al “Analysis of nonvolatile lipids by mass spectrometry”. Chem. Rev. 101.2 (2001): 479–526.

25. Polidoro M. “The Case of a Weeping Orthodox Icon”. Skeptical Inquirer. 36.1 (2012) [Electronic resource] URL: https://www.csicop.org/si/show/the_case_of_a_weeping_orthodox_icon. Date of access: 02.02.19.

26. Silliman C.C. et al. “Proteomic analyses of human plasma: Venus versus Mars”. Transfusion. 52.2 (2012): 417–424.

27. Wong S.Y., Lee C.C., Ashrafzadeh A. “A High-Yield Two-Hour Protocol for Extraction of Human Hair Shaft Proteins”. PLoS One. 11.10: e0164993 (2016) [Electronic resource] URL: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0164993. Date of access: 04.05.18.

Опубликовано: Томин, Н. В. Использование современных методов хромато-масс-спектрометрии для анализа «чудесных жидкостей», появляющихся на предметах религиозного культа / Н.В. Томин, И.С. Бутов, П.В. Флоренский, В.С. Алексинский, М.А. Дебелый // Пространство и Время. – 2019. – № 35. – С. 92–106. DOI: 10.24411/2226-7271-2019-11042.

Смотрите также:

Томин, Н. В. Мироточащие иконы: что говорит наука? / Н. В. Томин, И. С. Бутов, В. С. Алексинский, А. В. Московский, П. В. Флоренский, М. А. Дебелый // Природа. – №10. – 2019. – С. 9–18. DOI:10.7868/S0032874X19100028

Алексинский, В. С. Феномен мироточения: новая гипотеза и химико-микробиологический анализ мироточащих объектов / В. С. Алексинский, Т. Н. Соколова, И. С. Бутов, В. Н. Гайдучик, Р. В. Солженицын // Лабораторная диагностика. Восточная Европа. – 2017. – Том. 6. – №1. – С. 121–129.